Práctica 5: PRUEBA DE COOMBS

Introducción

Los anticuerpos anti-inmunoglobulina fueron desarrollados por Robin Coombs para estudiar la enfermedad hemolítica

del recién nacido o eritroblastosis fetal, y la prueba para detectar dicha enfermedad se llama aún Prueba de Coombs.

Es una prueba que busca anticuerpos que puedan fijarse a los glóbulos rojos y causar su destrucción prematura (hemólisis).

Fundamento:

Permite demostrar la presencia de anticuerpos incompletos mediante el uso de un segundo anticuerpo, que es una antiglobulina.

Hay dos formas de realizar  la prueba de Coombs: directa e indirecta.

PRUEBA DIRECTA

Detecta anticuerpos ya fijados a los hematíes y para ello se enfrentan los hematíes del paciente con antiglobulina. Se utiliza para detectar la enfermedad hemolítica del recién nacido y para otras anemias hemolíticas.

El suero de Coombs puede ser de dos clases: poliespecífico, si está dirigido contra la Ig G y el  componente C3d del complemento, y monoespecífico, si sólo esta dirigido contra la Ig G y algunos de los componentes del complemento.

Material

Gradilla. Centrífuga. Tubos de ensayo. Suero fisiológico. Pipetas Pasteur. Suero Coombs. Suspensión de hematíes problema.

Procedimiento

1.- Preparar una suspensión al 5% en solución salina.

2.- Colocar 1 gota de suero de Coombs en 1 tubo.

3.- Añadir 1-2 gotas de la suspensión.

4.- Mezclar y centrifugar 1-2 minutos a 2000 r.p.m.

5.-Sacar la centrifugadora y resuspender el botón celular y observar si hay o no aglutinación.                                                         Si hay aglutinación, hay Ac incompletos.

PRUEBA INDIRECTA

Fundamento:

Se pretende detectar generalmente la presencia en el suero del enfermo de Ac incompletos libres.               

Se incuba el suero del paciente con unos hematíes tipo (GR que no tienen adheridos a su superficie ningún tipo de Ig y ningún componente del complemento).                                                                                                                                                       La finalidad de esta incubación consiste en lograr una sensibilización in Vitro de los hematíes tipo por parte delos Ac incompletos que pueden estar contenidos en el suero problema. Los hematíes tipo que se suelen utilizar son los O+.

Material

Gradilla. Centrífuga. Tubos de ensayo. Solución salina. Pipetas Pasteur. Suero Coombs. Suspensión de hematíes al 5%.

Procedimiento

1.- Preparar una suspensión de hematíes tipo al 5% en solución salina.

2.- Colocar en un tubo 2 gotas de los hematíes tipo y 2 gotas de suero problema.

3.- Mezclar e incubar a 37⁰C durante 30 min.

4.- Lavar 3 veces el producto incubado en solución salina.

5.- Tras el último lavado resuspender el sedimento de hematíes.

6.-Añadir 2 gotas del suero de Coombs.

7.- Mezclar bien y centrifugar a 2000 r.p.m. de 1 a 2 minutos.

8.- Agitar el tubo y observar la presencia de aglutinación.

Resultados

Existencia de aglutinación	Presencia de Ac incompletos.
No existe aglutinación	No hay presencia de Ac incompletos.

Valores anormales

Una prueba de Coombs directa anormal (positiva) significa que se tienen Ac que actúan contra los hematíes, lo cual puede deberse a:

       Anemia hemolítica autoinmunitaria 

       Leucemia linfocítica crónica u otro transtorno linfoproliferativo.                                                                                    

       Anemia hemolítica inducida por fármacos.                                                                                                              

       Eritroblastosis fetal.                                                                                                                                                      

       Mononucleosis infecciosa.                                                                                                                                                    

       Infección por micoplasma.                                                                                                                                                          

       Sífilis.                                                                                                                                                                                      

       Lupus eritematoso sitémico u otra afección reumatológica.                                                                                     

       Reacción a transfusión sanguínea.

                                                                                                                                               

Una prueba de Coombs indirecta anormal (positiva) significa que se tienen Ac que actuarán  contra los hematíes, que el cuerpo asume como extraños.  Esto puede sugerir  la presencia de:

•        Anemia hemolítica autoinmunitaria o Anemia hemolítica inducida por fármacos.                                                     
•        Eritroblastosis fetal.     
•         Incompatibilidad sanguínea.                                                                                                                                               

                                                                                                                                                                                                                         

Referencias

Manual de prácticas de inmunología (Adriana Garibay Escobar)                          04/12/11    10:57  am. 

                                                                                                                                                                                                  

Práctica 6: PRUEBA A LA INVERSA (PRUEBA PARA GRUPOS ABO)

Objetivo

Al término de la práctica el alumno estará capacitado para comprobar o corroborar indudablemente la tipificación sanguínea.

Fundamento

El suero del paciente que contiene antígenos se ponen en contacto con los eritrocitos que contiene anticuerpos formando un complejo Ag-Ac, que se manifiesta microscópicamente mediante una aglutinación.

Materiales y sustancias

       Equipo de venopunción

       Placa de vidrio excavada

       Aplicadores

       Eritrocitos lavados A y B conocidos

       Suero del paciente.

Procedimiento

1.- Se preparan suspensiones de hematíes al 2% en la siguiente forma, en un tubo de ensayo marcado con la letra A se pone una gota de sangre A y otro marcado con la letra B se pone una gota de sangre B, se llenan los tubos con solución salina y se centrifugan a 3400 r.p.m. durante 3 minutos y se decanta el líquido sobrenadante invirtiendo los tubos.

2.- A cada uno de los tubos se añade 1cm de solución salina y se resuspenden los hematíes.

3.- Se ponen 2 gotas separadas de suero problema sobre una lámina de vidrio, a la gota de la izquierda se le agrega 1 gota de la suspensión de hematíes A y a la derecha 1 gota de la suspensión de hematíes B.

INTERPRETACIÓN

A)      Si el suero problema aglutina  los glóbulos rojos A significa que tiene Ac A, el suero que tiene Ac A corresponde a la sangre B, el suero problema, corresponde a una sangre del grupo B.

B)      Si el suero problema aglutina  los glóbulos rojos B significa que tiene Ac B, el suero que tiene Ac B corresponde a la sangre A, el suero problema, corresponde a una sangre del grupo A.

C)      Si el suero problema aglutina  los glóbulos rojos A y B significa que tiene Ac A y B, el suero que tiene Ac A y B corresponde a la sangre O, el suero problema, corresponde a una sangre del grupo O.

D)     Si el suero problema no aglutina  los glóbulos rojos A y B significa que no tiene Ac ni A ni B, por lo que el suero problema, corresponde a una sangre del grupo AB.

PRÁCTICAS DE LABORATORIO: 3 y 4

Práctica 3: DETECCIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA VIH

Trinity Biotech Uni-Gold^TM HIV

Introducción

En 1981 apareció el SIDA; se descubrió en  pacientes homosexuales, estos padecían 2 enfermedades no muy comunes, pero conocidas: neumocistosis y sarcoma de Kaposi.                                                                                                                                                                                                                          Se empezó a hablar entonces de una epidemia y el CDC (Centro de Control de las Enfermedades de Atlanta) dio nombre a la nueva enfermedad: Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA).

El VIH es un virus que ataca gradualmente las células del sistema inmunológico; las daña en forma progresiva, por lo que el cuerpo se vuelve más vulnerable a las infecciones, las cuales  son más difíciles de combatir. Pueden pasar años antes de que el VIH haya producido suficiente daño en el sistema inmune y que el SIDA se desarrolle.

La mayoría de los pacientes con SIDA o Complejos Relacionados con SIDA (ARC) tienen anticuerpos para las proteínas estructurales del virus de HIV. La infección por HIV se diagnostica mediante la detección de anticuerpos específicos para el virus. Se conocen dos tipos de HIV, HIV-1 y HIV-2 con 40-60% de aminoácidos homólogos entre las dos cepas.

La prueba de Uni-Gold^TM  de Trinity es un inmunoensayo rápido basado en el principio del sándwich inmunocromatográfico.

Fundamento

El motivo por el cual es de suma importancia la realización de esta práctica radica, en que, el SIDA es una enfermedad incurable que daña gradualmente las células del sistema inmunológico, por lo que es vital el conocimiento de su padecimiento para prevenir los contagios posteriores.

Contenido del equipo

a)       Cartuchos de prueba.

b)       Reactivo de lavado.

c)        Pipetas desechables.

d)       Inserto.

Para realizar la prueba se puede emplear sangre total, suero o plasma.

Procedimiento de prueba

1.- Marque cada prueba con la información apropiada del paciente.

2.- Utilizando una de las pipetas proporcionadas tome la muestra (suero/ plasma/ sangre total).

3.- Colocando la pipeta sobre el área de muestra adicione dos gotas de muestra (aproximadamente 60uL) cuidadosamente.

4.- Adicione 2 gotas del reactivo de lavado al área de muestra.

5.- Permita que transcurran exactamente 10 minutos para que la reacción ocurra. El resultado se debe de leer exactamente al final de 10 minutos de tiempo de incubación. Los resultados son estables aproximadamente durante 5 a 10 minutos.

Interpretación de resultados:                                               

NEGATIVO	Una línea en el área de control.
POSITIVO	Una línea de cualquier intensidad en el área de prueba, una segunda línea en el área de control.
INVÁLIDO	Ausencia de una línea en el área de control.

Resultado de la muestra procesada en el laboratorio escolar:      POSITIVO

Conclusión

Al tener conciencia de que se padece SIDA, es posible evitar transmitirla a otros, conociendo los medios por los que puede hacerse. Hasta el momento no hay cura para el SIDA, por lo que lo mejor es la prevención, evitando tener varias parejas sexuales, no compartiendo jeringas, no donando sangre ni órganos (en caso de ser seropositivo) , tomando las prevenciones necesarias durante el embarazo y evitando la lactancia de las madres seropositivas.

Referencias:

http://www.avert.org/sida.htm                                                                                         8:17pm      10/11/11

http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/000594.htm                     10:27pm      10/11/11       
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                           

   

Práctica 4: DETECCIÓN CUALITATIVA DE HBsAg

Prueba rápida de la hepatitis B, suero o plasma.

Introducción

La hepatitis viral es una enfermedad sistémica que implica sobre todo el hígado. La mayoría de las personas que adquieren el virus de la hepatitis B se recupera sin consecuencias. Esta forma de infección, que dura menos de 6 meses, se conoce como hepatitis B aguda. Por el contrario, cuando la infección perdura por más de 6 meses, se conoce como hepatitis B crónica. Aproximadamente el 5% de los adultos que adquieren la infección desarrollan la forma crónica. La probabilidad de desarrollar una hepatitis B crónica depende de la edad y del estado inmunitario (defensas) del sujeto, siendo mayor cuando se adquiere en la infancia que cuando se adquiere siendo adulto.

Las manifestaciones clínicas de la infección por el virus de la hepatitis B son muy variadas, y es importante recalcar que frecuentemente esta infección puede no dar ningún síntoma por muchos años lo cual no significa necesariamente que la infección esté controlada. El daño que produce el virus de la hepatitis B en el hígado es también variable y depende de la capacidad de reparación del hígado y de la capacidad del organismo de controlar la infección. Las consecuencias más importantes de esta infección en el largo plazo son el desarrollo de cirrosis hepática y de carcinoma hepatocelular.

El HBsAg una prueba rápida del paso es una prueba rápida para detectar cualitativo la presencia de HBsAg en especímenes del suero o del plasma. La prueba utiliza una combinación de anticuerpos monoclonales y policlonales para detectar selectivamente niveles elevados de HBsAg en suero o plasma.

Materiales suministrados:

       Un dispositivo del cassette

       Un cuentagotas de la pipeta

       Un desecativo

Procedimiento

1.        Las muestras de los pacientes y los controles deben estar a temperatura ambiente (18-30) antes de la prueba. Realizar el procedimiento como lo indica el instructivo.

2.        Retire el dispositivo de prueba de su bolsa de protección (llevar el dispositivo a temperatura ambiente antes de la apertura de la bolsa para evitar la condensación de la humedad en la membrana). Etiqueta el dispositivo con identificaciones de paciente o control.

3.        Sorteo de la muestra a la línea marcada en la pipeta (aproximadamente 60 uL).

4.        Espere 10-20 minutos y lea los resultados. No lea los resultados después de 30 minutos.

Interpretación de resultados

NEGATIVO	Una línea en el área de control.
POSITIVO	Una línea de cualquier intensidad en el área de prueba, una segunda línea en el área de control.
INVÁLIDO	Ausencia de una línea en el área de control.

Resultado de la muestra procesada en el laboratorio escolar:      NEGATIVO

Conclusión

La determinación del virus de la hepatitis en muestras de sangre forma parte de las pruebas necesarias para poder proporcionar unidades de sangre confiable, que posteriormente puedan  ser empleadas  en transfusiones sanguíneas. Es posible prevenir esta enfermedad mediante la vacunación.

Referencias:
http://hepatitis.cl/383/hepatitis-b                                  03/12/11    9:32 pm.         

Hepatitis B       (Joaquim Balanzó Tintore)               03/12/11    8:57 pm.